На странице размещены информационные материалы подразделений ЦКП.
Список оборудования и услуг каждого отделения приведены в разделах Оборудование и Услуги.
Для просмотра данных об отделении необходимо выбрать одно и отделений ЦКП.
Хроматографические методы исследования широко применяются для изучения объектов различного происхождения. В отделении имеется большая гамма хроматографического оборудования с различными детекторами, в том числе с масс-спектрометрическими. Методами газовой хроматографии в отделении исследуются летучие органические соединения, а методами жидкостной хроматографии — витамины, углеводы (сахара), фенольные соединения, пептиды.
В дополнение к хроматографическим методам имеется система капиллярного электрофореза, что позволяет работать со сверх малыми объемами образцов. Метод позволяет анализировать соединения разнообразной химической природы, как органические, так и неорганические (катионы, анионы).Более подробная информация об отделении на сайте Испытательной лаборатории ФИЦ Биотехнологии РАН www.ilab-inbi.ru
Масс-спектрометр с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией Bruker Daltonics Ultraflextreme
Масс-спектрометр Ultraflex предназначен для автоматизированных измерений масс-спектров веществ. Масс-спектрометр Ultraflex применяется при физико-химических исследованиях веществ и материалов в биохимии, биотехнологии, физической химии, химии синтетических полимеров, фармацевтике и медицине.
Прибор представляет собой автоматизированную многоцелевую измерительную систему, состоящую из ионного источника, вакуумной камеры, анализатора масс и персонального компьютера. В масс-спектрометре реализован тандемный режим, при котором используется более, чем одна стадия селекции масс ((MS)n-режим).
Ионизация производится лазерным излучением, взаимодействующим с пробами, расположенными в плоскости матрицы-мишени (Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization – MALDI метод).
Возможность программируемого сканирования проб обеспечивает высокую производительность анализа (до 384 за одну загрузку). Детектирование ионов осуществляется во время-пролетном анализаторе в линейном режиме и в режиме отражения. Прибор снабжен функцией LIFT, позволяющей производить предварительное фрагментирование ионов.
Масс-спектрометр Ultraflex позволяет определять массу продукта в диапазоне от 500Да до 120кДа, проводить идентификацию белков методом пептидного фингерпринта с помощью сервиса Mascot с предварительной обработкой спектров программным пакетом FlexAnalysis. Также возможно выявление аминокислотных замен и модификаций белка с помощью тандемного режима прибора.
Специализацией нашего подразделения является идентификация белков методом пептидного фингерпринта, проводятся обширные исследования протеома человека, MTB и других модельных объектов.Какую информацию можно получить из спектрофотомера ?
Электронно-колебательные спектры молекул в УФ и видимой области спектра представляют собой зависимость показателя поглощения монохроматического света от длины волны (частоты). Измеряемое спектрофотометром поглощение света молекулами является суммой чистого поглощения и светорассеяния.
1. Определение концентрации.
Наиболее широко используемым показателем поглощения являются коэффициенты поглощения (ε), которые определяется из соотношения ε = А/c∙ l , где
А — оптическая плотность образца (измеряемая спектрофотометром),
l — длина оптического пути (толщина кюветы, полимерной пленке и т.д),
с — молярная концентрация образца или же %-ное содержание вещества в растворе, полимерной пленке, полимерном блоке и т.д.Процентный (весовой) коэффициент поглощения используется в тех случаях, когда неизвестна молярная концентрация (например, белки с неизвестной первичной последовательностью).
При определении концентрации по спектрам поглощения необходимо помнить, что спектры поглощения имеют фундаментальную зависимость от температуры, диэлектрических свойств растворителя, светорассеяния. Основными источниками погрешности измерений являются:
а) смещение и искривление базовой линии в результате замены кюветы с растворителем на кювету с исследуемым раствором; б) погрешности в определении толщины кюветы; в) искажение формы спектра из-за рассеяния образца2. Контроль чистоты препарата.
3. Анализ многокомпонентной системы с сильно перекрывающимися полосами. Производится дифференцирование спектров (на спектрах второй производной полосы почти 2 раза уже), разложение спектров на гауссовы компоненты и т.д.
4. Измерение спектров линейного дихроизма (у ориентированных образцов)
5. Измерение дифференциальных спектров (окисленный минус восстановленный, свет минус темнота, пертурбации от температуры, влияние небольших добавок и т.д. )
6. Измерение кинетики реакций с детектированием на заданной длине волны
7. Измерение светорассеяния Релея ( в области где отсутствует поглощение )Какую информацию можно получить из спектрофлуориметра?
Флуоресценция — спонтанное излучение с нижнего синглетно-возбужденного уровня (S1 → S0). Константа скорости этого процесса (kf) определяется из площади под кривой в спектре поглощения полосы S0 → S1 и является очень стабильным параметром молекулы. Конкурирующие с излучением безизлучательные процессы дезактивации синглетного возбужденя (колебательная и тепловая дезактивация, переход в триплетное состояние, внутримолекулярный перенос протона и т.д.) напротив, могут сильно зависеть от свойств окружения (рН среды, окислительно-восстановительный потенциал, вязкость, ассоциация с другими молекулами, безизлучательный перенос энергии и т.д.). Эта особенность делает измерения спектров флуоресценции значительно более гибким и информативным инструментом исследования, чем спектры поглощения. Ограничением является то, что флуоресцируют преимущественно те молекулы, которые имеют систему сопряженных двойных связей в жестких циклах.
Экспериментальные возможности измерения.
1. Квантовый выход флуоресценции – отношение скорости излучении к скорости поглощения фотонов. Измеряется путем сравнения интенсивности излучения исследуемого образца со стандартом, сравниваются площади под спектральными кривыми.
2. Спектр флуоресценции (СФ) — распределение интенсивности излучения по длинам волн. Спектры измеряются для обнаружения флуоресцирующих молекул и определения их концентрации. Для определения концентрации флуорофора требуется сравнение с раствором известной концентрации.
3. Анализ многокомпонентной системы. Спектры флуоресценции не зависят от области возбуждения. Поэтому селективное возбуждение флуоресценции монохроматическим светом в разных областях поглощения позволяет обнаружить минимальные концентрации флуорофоров в сложных смесях.
4. Определение расстояния между флуоресцирующими молекулами при образовании комплексов или наличия флуорофоров в полимерной цепи возможно по эффекту безилучательного переноса энергии при наличии спектрально различающихся флуорфоров (в диапазоне 10-50 А).
5.Измерение поляризации флуоресценции позволяет оценить вязкость системы (мембран, липосом и т.д.) так как в истинных растворах флуоресценция деполяризована.
6. Измерение рН, окислительно-восстановительного потенциала, вязкости и т.д. осуществляется с применением специализированных меток и зондов.
7. Измерение кинетики реакций по изменению концентрации или по изменению квантового выхода флуорофора возможно при концентрациях на 2-3 порядка меньших, чем при детектировании по поглощению.Какую информацию можно получить из спектроскопии кругового дихроизма (КД)?
Сигнал КД — возникает из-за того, что оптически активные молекулы характеризуются разными коэффициентами экстинкции для монохроматического света с левой (left) — εl и правой (right) — εr циркулярной поляризацией. В результате возникает разница в оптической плотности:
ΔA = Al — Ar = εl cd — εr cd = (εl — εr)cd = Δε сd
где с – концентрация, d – оптический путь.
Величина ΔA обычно очень мала (Δε на 2-4 порядка меньше чем ε) и чувствительность современных спектрофотометров КД достигает 10-5 единиц оптической плотности. Такая чувствительность достигается за счет того, что высокочастотный модулятор попеременно преобразует монохроматический плоско поляризованный луч в свет с левой и с правой циркулярной поляризацией. Возникает очень маленькая модуляция интенсивности измеряющего света и, соответственно, тока фотодетектора. Электроника отфильтровывает и усиливает модулированную составляющую.
По свой форме, спектр КД, полностью совпадает со спектром поглощения (для изолированного электронного перехода). Однако, он может быть как положительным, так и отрицательным.
Амплитуда сигнала КД не коррелирует с амплитудой сигнала в спектре поглощения.Области применения:
1. Определение изомерии молекул.
2. Количественное определение состава смеси изомеров.
3. Определение конфигурации агрегатов (димеров, тримеров и т.д), когда имеет место экситонное расщепление электронных уровней.
4. Определение основных элементов вторичной структуры белков и пептидов. Широко используется для контроля за фолдингом рекомбинантных белков.
5. Определение термоустойчивости белков и пептидов по кривым плавления (от 5 до 90С)
6. Измерение кинетики реакций оптически активных молекул
7. Структура нуклеиновых кислот. Контроль образования квадруплексов у аптамеров.Получение конъюгатов наночастиц золота с белками и области их применения
Конъюгаты наночастиц золота (НЗ) с белками используют в иммуноанализе – иммуногистохимии, иммуноблоттинге, дот-иммуноанализе и иммунохроматографии, для визуального детектирования биоспецифических взаимодействий.
Иммуногистохимия – это метод исследования тканей с целью выявления белков с помощью специфической реакции антиген-антитело.
Дот-иммуноанализ основан на поперечном движении определяемого соединения и меченых иммунореагентов через пористый мембранный носитель с иммобилизованными антителами.
Иммуноблоттинг – перенесение на твердый носитель белков, разделенных с помощью электрофореза, с последующим выявлением иммунных комплексов с помощью меченых антител.
Иммунохроматографический анализ основан на движении элюента вдоль мембраны, которое приводит к образованию на разных ее участках специфических иммунных комплексов. Конъюгированный с одним из иммунореагентов (чаще всего с антителами) окрашенный маркер распределяется по мембране, и его наличие в определенных участках мембраны по окончании анализа дает информацию о наличии или отсутствии в пробе определяемых соединений.
В качестве окрашенного маркера чаще всего используют НЗ диаметром от 5 до 50 нм. Наиболее распространенным методом получения НЗ является метод цитратного восстановления золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК). Метод заключается в том, что к кипящему водному раствору ЗХВК добавляют раствор цитрата натрия в количестве, зависящем от требуемого размера частиц.
На поверхность полученных таким образом НЗ адсорбционно иммобилизуют антитела, получая конъюгаты антитела–НЗ. Оптимальную концентрацию белка при конъюгации с НЗ устанавливают на основании флокуляционных кривых, отражающих агрегацию конъюгатов при высокой ионной силе. Для построения этих флокуляционных кривых оптическую плотность агрегирующих НЗ определяют при длине волны 580 нм с использованием микропланшетного фотометра Multiskan EX.
Осаждение конъюгатов антитела–НЗ, отделяющее образовавшиеся комплексы от непровзаимодействовавших молекул антител, проводят с использованием высокоскоростной настольной центрифуги с охлаждением Allegra 64R, укомплектованной тремя роторами.Характеристики роторов
Обозначение ротора Макc. скорость при 20°С, об/мин Макс. ускорение при 20°С, g Макс. скорость при 4°С, об/мин Макс. ускорение при 4°С, g Макс. емкость, мл
F1202 30 000 64 400 28 500 58 120 12 х 1,5 F1010 26 000 57 440 22 500 43 020 10 х 10 F0650 21 000 41 420 18 500 32 140 6 х 50 От качества конъюгатов антитела–НЗ в значительной степени зависят качество и стабильность иммунохроматографической тест-системы в целом. Чтобы выбрать наиболее эффективный для решения данных задач препарат, варьируют размеры НЗ, соотношение антитела : НЗ и режим иммобилизации.
Тестирование полученных в результате этого варьирования конъюгатов антитела–НЗ по функциональной активности – степени сохранения способности иммобилизуемого белка к рецептор-лигандным взаимодействиям (антитело-антиген, фермент-ингибитор и др.) – проводят методами иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного фотометра Multiskan EX (длина волны 450 нм) и иммунохроматографического анализа.Ферментация.
Биотехнологические процессы наработки целевого продукта при помощи микроорганизмов могут быть основаны на периодическом культивировании (batch), периодическом культивировании с подпиткой (feed-batch) и непрерывном культивировании. В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой. Однако, в ЦКП широко применяются методы batch и feed-batch культивирования, на них и остановимся более подробно.
Ферментер — это закрытая емкость, в которой при определенных, контролируемых условиях (давление, температура, концентрация сухих веществ, рН среды и т.д.) осуществляется размножение штамма-продуцента с одновременной или последующей наработкой целевого продукта. Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальную фазу роста (нуклеотиды, многие ферменты, витамины — первичные метаболиты), так и в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. — так называемые вторичные метаболиты).
Периодический процесс (batch, feed-batch) включает:
1) стерилизацию сред, ферментеров и вспомогательного оборудования;
2) загрузку аппарата питательной средой;
3) внесение посевного материала;
4-1) рост культуры, который совпадает во времени с синтезом целевого продукта (batch);
4-2) рост культуры с последующим синтезом целевого продукта (feed-batch);
5) отделение целевого продукта (клетки или культуральная жидкость).
При использовании периодического (batch) процесса в течение цикла культивирования питательные вещества в среду дополнительно не вводятся, продукты обмена не удаляются (не считая тех, что уносятся с газом в процессе аэрации); когда содержание целевого продукта достигает максимума, процесс прекращают. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса.
Рис. 1 Кривые роста, исчерпания субстрата и накопления продукта в batch процессе.Использование периодического процесса с подпиткой (feed-batch) позволяет достичь большего выхода целевого продукта за счет пролонгированного роста и достижения большего объема биомассы, обусловленных применением дополнительных питательных веществ (субстрат, витамины и микроэлементы, индуктор), добавляемых как непрерывно, так и дробно (по сигналу датчика).
Этот тип ферментации имеет ряд важных преимущества:
- Многие целевые продукты (антибиотики, внеклеточные ферменты, полисахариды и др.), являются вторичными метаболитами, т. е. синтезируются по окончании экспоненциальной фазы роста клеток. Для того чтобы восполнять истощившуюся к этому времени питательную среду, в нее необходимо добавлять свежие питательные вещества, а также вещества-предшественники продукта.
- Периодическое использование подпитки позволяет избежать эффекта ингибирования субстратом (высокие концентрации глюкозы, этанола) или индуктором (метанол).
- Позволяет достигать большего выхода биомассы.
Рис. 2 Кривые роста, подпитки и накопления продукта в feed-batch процессе.
Выбор типа ферментации и среды культивирования, как правило, обусловлен совокупностью ряда факторов:
- Целевой белок-первичный или вторичный метаболит
- Токсичность целевого белка для клеток продуцента
- Стабильность целевого белка
- Структурно-функциональные особенности целевого белка
КЛОНИРОВАНИЕ.
В ЦКП активно применяются как многокопийные, плазмидные системы, так и различные интегративные экспрессионные вектора для прокариотической (E.coli) и эукариотической (дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris) системы экспрессии, используются различные селективные маркеры.
Прокариотическая система экспрессии является одним из наиболее распространенных инструментов для получения рекомбинантных белков. К преимуществам использования данной системы следует отнести:- Потенциально очень высокие уровни экспрессии
- Низкая себестоимость
- Высокая скорость и простота выращивания
- Наличие многих факторов, позволяющих оптимизировать экспрессию.
Несмотря на огромные преимущества прокариотическая система экспрессии обладает рядом недостатков:
- Минимальные пост-трансляционные модификации
- Проблемы с фолдингом белка (нарушение формирования белков в цитоплазме, включая бактериальные белки, возможные нарушения конформации, неэффективное формирование дисульфидных связей и тд.)
- Неэффективный рефолдинг in vitro (часто нивелирует все преимущества системы в наработке белка)
- Кодоны отличаются от эукариотических
- Наличие эндотоксинов
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae длительное время находятся в лидирующей группе микробиологических объектов, используемых для продукции белков, обладающих медицинской или технической ценностью. Это обусловлено как историческими, так и технологическими причинами, среди которых необходимо отметить – биобезопасность, относительную простоту организации, доступность простых методов трансформации клеток и генетических манипуляций. К достоинствам данной системы экспрессии следует отнести:
- Способность к реализации большинства эукариотических пост-трансляционных модификаций
- Эффективный фолдинг белка
- Высокие уровни экспрессии
- Низкая стоимость и простота культивирования
- Возможность выбора между внутриклеточной продукцией и секрецией
- Отсутствие эндотоксинов
- Оптимизированный шаперонный и протеолитический статус
К недостаткам данной системы следует отнести:
- Как правило, более низкая экспрессия и секреция целевого белка, чем у Pichia pastoris
- Гликозилирование отличается от клеток человека и млекопитающих
- Тенденция к гипергликозилированию белков (N – гликановые структуры считаются аллергенными)
Одной из самых перспективных систем эукариотической гетерологичной экспрессии является технология получения рекомбинантных белков при использовании высокоплотного культивирования метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. К достоинствам данной системы относятся:
- Способность к реализации большинства эукариотических пост-трансляционных модификаций
- Эффективный фолдинг белка
- Высокие уровни экспрессии
- Низкая стоимость и простота культивирования
- Возможность выбора между внутриклеточной продукцией и секрецией
- N-гликозилирование больше похоже на гликозилирование у высших эукариот, чем у Saccharomyces cerevisiae
- Отсутствие эндотоксинов
К недостаткам данной системы следует отнести:
- Гликозилирование отличается от клеток человека и млекопитающих
- Использование метанола (токсичное, легко-воспламеняющееся вещество) в качестве индуктора экспрессии.
Несмотря на активное развитие генной инженерии и огромное количество литературных данных, касающихся получения гомо- и гетерологичной рекомбинантных белков, основной проблемой стоящей перед исследователем до сих пор является выбор системы экспрессии целевого белка. К сожалению, универсальной системы экспрессии еще не разработано и при выборе реципиента исследователь должен учитывать как фундаментальные свойства каждой системы, их плюсы и минусы, так структурно-функциональные особенности целевого белка.
Лабораторная установка по культивированию микроорганизмов.
1.В состав установки входят 2 блока ферментеров по 4 ферментера в каждом.
Ферментеры оборудованы системой перемешивания, подачи воздуха, охлаждения и нагрева.
Ферментеры оснащены датчиками измерения температуры, pH и растворенного кислорода. Электроды рН и рО2 стерилизуемы.
Показания с датчиков выводятся на экран монитора компьютера. Управление процесса культивирования микроорганизмов осуществляют с помощью компьютера. При выращивании микроорганизмов возможно термостатирование, рН-статирование, можно поддерживать постоянное значение рО2 за счет увеличения оборотов мешалки.
В ферментерах можно проводить выращивание бактерий, дрожжей и грибов.2. 8 стерилизуемых аппаратов с рабочим объёмом 1,5 литра и 2 объёмом 10 литров.
Данные ферментёры так же оборудованы системами перемешивания, подачи воздуха и термостатирования. Имеются датчики контроля рН, растворимого кислорода и температуры. К каждому аппарату прилагается контроллер. На контроллер выводятся показания со всех датчиков, имеется возможность наблюдать ход процесса в динамике и, при необходимости, вносить корректировки. Для подготовки стерильных питательных сред в состав установки входят автоклавы. Для выращивания инокулята имеется термостатируемая напольная качалка.