Отделения ЦКП

На странице размещены информационные материалы подразделений ЦКП.
Список оборудования и услуг каждого отделения приведены в разделах Оборудование и Услуги.

Для просмотра данных об отделении необходимо выбрать одно и отделений ЦКП.


  • Хроматографические методы исследования широко применяются для изучения объектов различного происхождения. В отделении имеется большая гамма хроматографического оборудования с различными детекторами, в том числе с масс-спектрометрическими. Методами газовой хроматографии в отделении исследуются летучие органические соединения, а методами жидкостной хроматографии — витамины, углеводы (сахара), фенольные соединения, пептиды.
    В дополнение к хроматографическим методам имеется система капиллярного электрофореза, что позволяет работать со сверх малыми объемами образцов. Метод позволяет анализировать соединения разнообразной химической природы, как органические, так и неорганические (катионы, анионы).

    Более подробная информация об отделении на сайте Испытательной лаборатории ФИЦ Биотехнологии РАН www.ilab-inbi.ru

     

  • Масс-спектрометр с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией Bruker Daltonics Ultraflextreme

    Масс-спектрометр Ultraflex предназначен для автоматизированных измерений масс-спектров веществ. Масс-спектрометр Ultraflex применяется при физико-химических исследованиях веществ и материалов в биохимии, биотехнологии, физической химии, химии синтетических полимеров, фармацевтике и медицине.
    Прибор представляет собой автоматизированную многоцелевую измерительную систему, состоящую из ионного источника, вакуумной камеры, анализатора масс и персонального компьютера. В масс-спектрометре реализован тандемный режим, при котором используется более, чем одна стадия селекции масс ((MS)n-режим).
    Ионизация производится лазерным излучением, взаимодействующим с пробами, расположенными в плоскости матрицы-мишени (Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization – MALDI метод).
    Возможность программируемого сканирования проб обеспечивает высокую производительность анализа (до 384 за одну загрузку). Детектирование ионов осуществляется во время-пролетном анализаторе в линейном режиме и в режиме отражения. Прибор снабжен функцией LIFT, позволяющей производить предварительное фрагментирование ионов.
    Масс-спектрометр Ultraflex позволяет определять массу продукта в диапазоне от 500Да до 120кДа,  проводить идентификацию белков методом пептидного фингерпринта с помощью сервиса Mascot с предварительной обработкой спектров программным пакетом FlexAnalysis. Также возможно выявление аминокислотных замен и модификаций белка с помощью тандемного режима прибора.
    Специализацией нашего подразделения является идентификация белков методом пептидного фингерпринта, проводятся обширные исследования протеома человека, MTB и других модельных объектов.

     

  • Какую информацию можно получить из спектрофотомера ?

    Электронно-колебательные спектры  молекул в  УФ  и видимой области спектра  представляют собой зависимость  показателя  поглощения монохроматического  света   от  длины  волны  (частоты).  Измеряемое спектрофотометром поглощение света  молекулами является  суммой чистого поглощения и светорассеяния.

    1. Определение концентрации.
    Наиболее широко используемым   показателем  поглощения   являются коэффициенты поглощения  (ε),   которые  определяется  из соотношения     ε =  А/c∙ l ,    где
    А —  оптическая  плотность образца  (измеряемая  спектрофотометром),
    l  — длина оптического пути  (толщина кюветы, полимерной пленке и т.д),
    с  — молярная концентрация образца или же   %-ное содержание  вещества в растворе, полимерной пленке, полимерном блоке и т.д.

    Процентный (весовой)  коэффициент поглощения используется в тех случаях, когда неизвестна молярная концентрация (например,  белки с неизвестной первичной последовательностью).
    При определении концентрации по спектрам поглощения необходимо помнить, что спектры  поглощения  имеют фундаментальную зависимость  от температуры,  диэлектрических свойств растворителя, светорассеяния.  Основными источниками погрешности  измерений являются:
    а) смещение и искривление базовой линии в результате замены кюветы с растворителем    на кювету с исследуемым раствором; б) погрешности в определении толщины кюветы;   в) искажение формы спектра из-за рассеяния  образца

    2. Контроль чистоты препарата.
    3. Анализ многокомпонентной системы с сильно перекрывающимися полосами.
      Производится дифференцирование спектров (на спектрах второй производной полосы почти 2 раза уже),   разложение спектров на гауссовы компоненты  и т.д.
    4. Измерение спектров линейного дихроизма  (у ориентированных образцов)
    5. Измерение дифференциальных спектров   (окисленный минус восстановленный, свет минус темнота,  пертурбации от температуры, влияние небольших добавок и т.д. )
    6. Измерение кинетики реакций с детектированием на заданной длине волны
    7. Измерение светорассеяния Релея
    ( в области где отсутствует поглощение )

     

     Какую информацию можно получить из спектрофлуориметра?

    Флуоресценция  — спонтанное излучение с нижнего синглетно-возбужденного  уровня     (S1  → S0).  Константа скорости этого процесса (kf)  определяется из площади под кривой в  спектре поглощения полосы  S0  → S1 и является очень стабильным параметром молекулы.  Конкурирующие с излучением безизлучательные  процессы дезактивации  синглетного  возбужденя (колебательная и тепловая дезактивация, переход в триплетное состояние, внутримолекулярный перенос протона    и т.д.)  напротив,  могут сильно зависеть от свойств окружения (рН среды, окислительно-восстановительный потенциал, вязкость,  ассоциация с другими молекулами, безизлучательный перенос энергии и т.д.).   Эта особенность делает измерения спектров флуоресценции  значительно более гибким и информативным инструментом исследования, чем спектры поглощения.  Ограничением является то, что флуоресцируют преимущественно те  молекулы, которые имеют систему сопряженных двойных связей  в жестких  циклах.

    Экспериментальные возможности  измерения.
    1.
    Квантовый выход флуоресценции отношение скорости излучении к скорости поглощения фотонов. Измеряется  путем сравнения интенсивности излучения  исследуемого  образца  со стандартом, сравниваются площади под спектральными кривыми.
    2. Спектр флуоресценции (СФ) — распределение интенсивности излучения по длинам волн. Спектры измеряются для обнаружения флуоресцирующих молекул и определения  их концентрации.  Для  определения  концентрации флуорофора  требуется  сравнение с    раствором известной концентрации.
    3. Анализ многокомпонентной системы. Спектры флуоресценции не зависят от области  возбуждения.    Поэтому  селективное возбуждение флуоресценции монохроматическим светом в разных областях поглощения позволяет обнаружить минимальные концентрации флуорофоров  в сложных смесях.
    4. Определение расстояния между флуоресцирующими молекулами при образовании  комплексов или наличия флуорофоров  в полимерной цепи  возможно по эффекту безилучательного  переноса энергии  при наличии спектрально различающихся  флуорфоров (в диапазоне 10-50 А).
    5.Измерение поляризации флуоресценции позволяет оценить вязкость  системы   (мембран, липосом  и т.д.) так как  в истинных растворах флуоресценция  деполяризована.
    6. Измерение рН, окислительно-восстановительного потенциала, вязкости и т.д. осуществляется  с применением  специализированных  меток и зондов.
    7. Измерение кинетики реакций  по изменению концентрации  или по изменению  квантового  выхода  флуорофора  возможно при концентрациях на 2-3 порядка  меньших, чем при детектировании по поглощению.  

        Какую информацию можно получить из спектроскопии  кругового дихроизма  (КД)?

    Сигнал КД  — возникает из-за  того, что оптически активные молекулы  характеризуются  разными  коэффициентами  экстинкции  для монохроматического  света  с левой (left) — εl  и  правой (right) — εr  циркулярной поляризацией.  В результате возникает разница в  оптической плотности:
                               ΔA  =   Al  — Ar  =   εl cd  —  εr cd  =  (εl —  εr)cd   =  Δε сd
    где  с – концентрация,  d – оптический путь.
    Величина   ΔA обычно очень мала (Δε на 2-4 порядка меньше чем ε) и чувствительность современных спектрофотометров  КД  достигает 10-5  единиц оптической  плотности.  Такая чувствительность достигается за счет того, что   высокочастотный  модулятор попеременно  преобразует  монохроматический плоско поляризованный  луч  в свет с левой  и с  правой циркулярной поляризацией.  Возникает очень маленькая модуляция  интенсивности измеряющего света и, соответственно, тока фотодетектора.  Электроника отфильтровывает и усиливает модулированную   составляющую.
    По свой форме,  спектр КД,  полностью  совпадает со спектром поглощения  (для изолированного электронного перехода).  Однако, он может быть как положительным, так и отрицательным.
    Амплитуда сигнала КД не коррелирует с амплитудой сигнала в спектре поглощения.

    Области применения:

    1. Определение изомерии молекул.
    2.  Количественное определение состава смеси изомеров.
    3. Определение конфигурации агрегатов (димеров, тримеров и т.д), когда имеет место экситонное расщепление  электронных уровней.
    4. Определение основных элементов вторичной структуры белков и пептидов. Широко используется для контроля за фолдингом рекомбинантных белков.
    5. Определение термоустойчивости  белков и пептидов  по кривым плавления (от 5 до 90С)
    6. Измерение кинетики реакций оптически активных молекул
    7.  Структура нуклеиновых кислот.  Контроль образования квадруплексов у аптамеров.

  • Получение конъюгатов наночастиц золота с белками и области их применения

    Конъюгаты наночастиц золота (НЗ) с белками используют в иммуноанализе – иммуногистохимии, иммуноблоттинге, дот-иммуноанализе и иммунохроматографии, для визуального детектирования биоспецифических взаимодействий.
    Иммуногистохимия – это метод исследования тканей с целью выявления белков с помощью специфической реакции антиген-антитело.
    Дот-иммуноанализ основан на поперечном движении определяемого соединения и меченых иммунореагентов через пористый мембранный носитель с иммобилизованными антителами.
    Иммуноблоттинг – перенесение на твердый носитель белков, разделенных с помощью электрофореза, с последующим выявлением иммунных комплексов с помощью меченых антител.
    Иммунохроматографический анализ основан на движении элюента вдоль мембраны, которое приводит к образованию на разных ее участках специфических иммунных комплексов. Конъюгированный с одним из иммунореагентов (чаще всего с антителами) окрашенный маркер распределяется по мембране, и его наличие в определенных участках мембраны по окончании анализа дает информацию о наличии или отсутствии в пробе определяемых соединений.
    В качестве окрашенного маркера чаще всего используют НЗ диаметром от 5 до 50 нм. Наиболее распространенным методом получения НЗ является метод цитратного восстановления  золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК).  Метод заключается в том, что к кипящему водному раствору ЗХВК добавляют раствор цитрата натрия в количестве, зависящем от требуемого размера частиц.
    На поверхность полученных таким образом НЗ адсорбционно иммобилизуют антитела, получая конъюгаты антитела–НЗ. Оптимальную концентрацию белка при конъюгации с НЗ устанавливают на основании флокуляционных кривых, отражающих агрегацию конъюгатов при высокой ионной силе. Для построения этих флокуляционных кривых оптическую плотность агрегирующих НЗ определяют при длине волны 580 нм с использованием микропланшетного фотометра Multiskan EX.
    Осаждение конъюгатов антитела–НЗ, отделяющее образовавшиеся комплексы от непровзаимодействовавших молекул антител, проводят с использованием высокоскоростной настольной центрифуги с охлаждением Allegra 64R, укомплектованной тремя роторами.

    Характеристики роторов

    Обозначение ротора Макc. скорость при 20°С, об/мин Макс. ускорение при 20°С, g Макс. скорость при 4°С, об/мин Макс. ускорение при 4°С, g Макс. емкость,

    мл

    F1202 30 000 64 400 28 500 58 120 12 х 1,5
    F1010 26 000 57 440 22 500 43 020 10 х 10
    F0650 21 000 41 420 18 500 32 140 6 х 50

    От качества конъюгатов антитела–НЗ в значительной степени зависят качество и стабильность иммунохроматографической тест-системы в целом. Чтобы выбрать наиболее эффективный для решения данных задач препарат, варьируют размеры НЗ, соотношение антитела : НЗ и режим иммобилизации.
    Тестирование полученных в результате этого варьирования конъюгатов антитела–НЗ по функциональной активности – степени сохранения способности иммобилизуемого белка к рецептор-лигандным взаимодействиям (антитело-антиген, фермент-ингибитор и др.) – проводят методами иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного фотометра Multiskan EX (длина волны 450 нм) и иммунохроматографического анализа.

  • Ферментация.

    Биотехнологические процессы наработки целевого продукта при помощи микроорганизмов могут быть основаны на периодическом культивировании (batch), периодическом культивировании с подпиткой (feed-batch) и непрерывном культивировании. В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой. Однако, в ЦКП широко применяются методы batch и feed-batch культивирования, на них и остановимся более подробно.
    Ферментер — это закрытая емкость, в которой при определенных, контролируемых условиях (давление, температура, концен­трация сухих веществ, рН среды и т.д.) осуществляется размножение штамма-продуцента с одновременной или последующей наработкой целевого продукта.  Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальную фазу роста (нуклеотиды, многие ферменты, витамины — первичные метаболиты), так и в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. — так называемые вторичные метаболиты).
    Периодический процесс (batch, feed-batch) включает:
    1) стерилизацию сред, ферментеров и вспомогательного оборудования;
    2) загрузку аппарата питательной средой;
    3) внесение посевного материала;
    4-1) рост культуры, который совпадает во времени с синтезом целевого продукта (batch);
    4-2) рост культуры с последующим синтезом целевого продукта (feed-batch);
    5) отделение целевого продукта (клетки или культуральная жидкость).
    При использовании периодического (batch) процесса в течение цикла культивирования питательные вещества в среду дополнительно не вводятся, продукты обмена не удаляются (не считая тех, что уносятся с газом в процессе аэрации); когда содержание целевого продукта достигает максимума, процесс прекращают. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса.


    Рис. 1 Кривые роста, исчерпания субстрата  и накопления продукта в  batch процессе.

    Использование периодического процесса с подпиткой (feed-batch) позволяет достичь большего выхода целевого продукта за счет пролонгированного роста и достижения большего объема биомассы, обусловленных применением дополнительных питательных веществ (субстрат, витамины и микроэлементы, индуктор), добавляемых как непрерывно, так и дробно (по сигналу датчика).

    Этот тип ферментации имеет ряд важных преимущества:

    • Многие целевые продукты (антибиотики, внеклеточные ферменты, полисахариды и др.), являются вторичными метаболитами, т. е. синтезируются по окончании экспоненциальной фазы роста клеток. Для того чтобы восполнять истощившуюся к этому времени питательную среду, в нее необходимо добавлять свежие питательные вещества, а также вещества-предшественники продукта.
    • Периодическое использование подпитки позволяет избежать эффекта ингибирования субстратом (высокие концентрации глюкозы, этанола) или индуктором (метанол).
    • Позволяет достигать большего выхода биомассы.

    Рис. 2 Кривые роста, подпитки и накопления продукта в  feed-batch процессе.

    Выбор типа ферментации и среды культивирования, как правило, обусловлен совокупностью ряда факторов:

    • Целевой белок-первичный или вторичный метаболит
    • Токсичность целевого белка для клеток продуцента
    • Стабильность целевого белка
    • Структурно-функциональные особенности целевого белка

    КЛОНИРОВАНИЕ.

    В ЦКП активно применяются как многокопийные, плазмидные системы, так и различные интегративные экспрессионные вектора для прокариотической (E.coli) и эукариотической (дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris) системы экспрессии, используются различные селективные маркеры.
    Прокариотическая система экспрессии является одним из наиболее распространенных инструментов для получения рекомбинантных белков. К преимуществам использования данной системы следует отнести:

    • Потенциально очень высокие уровни экспрессии
    • Низкая себестоимость
    • Высокая скорость и простота выращивания
    • Наличие многих факторов, позволяющих оптимизировать экспрессию.

    Несмотря на огромные преимущества прокариотическая система экспрессии обладает рядом недостатков:

    • Минимальные пост-трансляционные модификации
    • Проблемы с фолдингом белка (нарушение формирования белков в цитоплазме, включая бактериальные белки, возможные нарушения конформации, неэффективное формирование дисульфидных связей и тд.)
    • Неэффективный рефолдинг in vitro (часто нивелирует все преимущества системы в наработке белка)
    • Кодоны отличаются от эукариотических
    • Наличие эндотоксинов

    Дрожжи Saccharomyces cerevisiae длительное время находятся в лидирующей группе микробиологических объектов, используемых для продукции белков, обладающих ме­дицинской или технической ценностью. Это обусловлено как исто­ри­ческими, так и технологическими причинами, среди которых необходимо отметить – биобезопасность, относительную простоту организации, доступ­ность простых мето­дов трансформации клеток и генетических манипуляций. К достоинствам данной системы экспрессии следует отнести:

    • Способность к реализации большинства эукариотических пост-трансляционных модификаций
    • Эффективный фолдинг белка
    • Высокие уровни экспрессии
    • Низкая стоимость и простота культивирования
    • Возможность выбора между внутриклеточной продукцией и секрецией
    • Отсутствие эндотоксинов
    • Оптимизированный шаперонный и протеолитический статус

    К недостаткам данной системы следует отнести:

    • Как правило, более низкая экспрессия и секреция целевого белка, чем у Pichia pastoris
    • Гликозилирование отличается от клеток человека и млекопитающих
    • Тенденция к гипергликозилированию белков (N – гликановые структуры считаются аллергенными)

    Одной из самых перспективных систем эукариотической гетерологичной экспрессии является технология получения рекомбинантных белков при использовании высокоплотного культивирования метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. К достоинствам данной системы относятся:

    • Способность к реализации большинства эукариотических пост-трансляционных модификаций
    • Эффективный фолдинг белка
    • Высокие уровни экспрессии
    • Низкая стоимость и простота культивирования
    • Возможность выбора между внутриклеточной продукцией и секрецией
    • N-гликозилирование больше похоже на гликозилирование у высших эукариот, чем у Saccharomyces cerevisiae
    • Отсутствие эндотоксинов

    К недостаткам данной системы следует отнести:

    • Гликозилирование отличается от клеток человека и млекопитающих
    • Использование метанола (токсичное, легко-воспламеняющееся вещество) в качестве индуктора экспрессии.

    Несмотря на активное развитие генной инженерии и огромное количество литературных данных, касающихся получения гомо- и гетерологичной рекомбинантных белков, основной проблемой стоящей перед исследователем до сих пор является выбор системы экспрессии целевого белка.  К сожалению, универсальной системы экспрессии еще не разработано и при выборе реципиента исследователь должен учитывать как фундаментальные свойства каждой системы, их плюсы и минусы, так структурно-функциональные особенности целевого белка.

     

  • Лабораторная установка по культивированию микроорганизмов.

    1.В состав установки входят 2 блока ферментеров по 4 ферментера в каждом.
    Ферментеры оборудованы системой перемешивания, подачи воздуха, охлаждения и нагрева.
    Ферментеры оснащены датчиками измерения температуры, pH и растворенного кислорода. Электроды рН и рО2 стерилизуемы.
    Показания с датчиков выводятся на экран монитора компьютера. Управление процесса культивирования микроорганизмов осуществляют с помощью компьютера. При выращивании микроорганизмов возможно термостатирование, рН-статирование, можно поддерживать постоянное значение рО2 за счет увеличения оборотов мешалки.
    В ферментерах можно проводить выращивание бактерий, дрожжей и грибов.

    2. 8 стерилизуемых аппаратов с рабочим объёмом 1,5 литра и 2 объёмом 10 литров.
    Данные ферментёры так же оборудованы системами перемешивания, подачи воздуха и  термостатирования. Имеются датчики контроля рН, растворимого кислорода и температуры. К каждому аппарату прилагается контроллер. На контроллер выводятся показания со всех датчиков, имеется возможность наблюдать ход процесса в динамике и, при необходимости, вносить корректировки. Для подготовки стерильных питательных сред в состав установки входят автоклавы. Для выращивания инокулята имеется термостатируемая  напольная качалка.

     

Яндекс.Метрика