Отделения ЦКП

На странице размещены информационные материалы подразделений ЦКП. Список оборудования и услуг каждого отделения приведены в разделах Оборудование и Услуги. Для просмотра данных об отделении необходимо выбрать одно и отделений ЦКП.
  • Хроматографические методы исследования широко применяются для изучения объектов различного происхождения. В отделении имеется большая гамма хроматографического оборудования с различными детекторами, в том числе с масс-спектрометрическими. Методами газовой хроматографии в отделении исследуются летучие органические соединения, а методами жидкостной хроматографии - витамины, углеводы (сахара), фенольные соединения, пептиды. В дополнение к хроматографическим методам имеется система капиллярного электрофореза, что позволяет работать со сверх малыми объемами образцов. Метод позволяет анализировать соединения разнообразной химической природы, как органические, так и неорганические (катионы, анионы). Более подробная информация об отделении на сайте Испытательной лаборатории ФИЦ Биотехнологии РАН www.ilab-inbi.ru  
  • Масс-спектрометр с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией Bruker Daltonics Ultraflextreme

    Масс-спектрометр Ultraflex предназначен для автоматизированных измерений масс-спектров веществ. Масс-спектрометр Ultraflex применяется при физико-химических исследованиях веществ и материалов в биохимии, биотехнологии, физической химии, химии синтетических полимеров, фармацевтике и медицине. Прибор представляет собой автоматизированную многоцелевую измерительную систему, состоящую из ионного источника, вакуумной камеры, анализатора масс и персонального компьютера. В масс-спектрометре реализован тандемный режим, при котором используется более, чем одна стадия селекции масс ((MS)n-режим). Ионизация производится лазерным излучением, взаимодействующим с пробами, расположенными в плоскости матрицы-мишени (Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization – MALDI метод). Возможность программируемого сканирования проб обеспечивает высокую производительность анализа (до 384 за одну загрузку). Детектирование ионов осуществляется во время-пролетном анализаторе в линейном режиме и в режиме отражения. Прибор снабжен функцией LIFT, позволяющей производить предварительное фрагментирование ионов. Масс-спектрометр Ultraflex позволяет определять массу продукта в диапазоне от 500Да до 120кДа,  проводить идентификацию белков методом пептидного фингерпринта с помощью сервиса Mascot с предварительной обработкой спектров программным пакетом FlexAnalysis. Также возможно выявление аминокислотных замен и модификаций белка с помощью тандемного режима прибора. Специализацией нашего подразделения является идентификация белков методом пептидного фингерпринта, проводятся обширные исследования протеома человека, MTB и других модельных объектов.

     
  • Какую информацию можно получить из спектрофотомера ? Электронно-колебательные спектры  молекул в  УФ  и видимой области спектра  представляют собой зависимость  показателя  поглощения монохроматического  света   от  длины  волны  (частоты).  Измеряемое спектрофотометром поглощение света  молекулами является  суммой чистого поглощения и светорассеяния. 1. Определение концентрации. Наиболее широко используемым   показателем  поглощения   являются коэффициенты поглощения  (ε),   которые  определяется  из соотношения     ε =  А/c∙ l ,    где А -  оптическая  плотность образца  (измеряемая  спектрофотометром), l  - длина оптического пути  (толщина кюветы, полимерной пленке и т.д), с  - молярная концентрация образца или же   %-ное содержание  вещества в растворе, полимерной пленке, полимерном блоке и т.д. Процентный (весовой)  коэффициент поглощения используется в тех случаях, когда неизвестна молярная концентрация (например,  белки с неизвестной первичной последовательностью). При определении концентрации по спектрам поглощения необходимо помнить, что спектры  поглощения  имеют фундаментальную зависимость  от температуры,  диэлектрических свойств растворителя, светорассеяния.  Основными источниками погрешности  измерений являются: а) смещение и искривление базовой линии в результате замены кюветы с растворителем    на кювету с исследуемым раствором; б) погрешности в определении толщины кюветы;   в) искажение формы спектра из-за рассеяния  образца 2. Контроль чистоты препарата. 3. Анализ многокомпонентной системы с сильно перекрывающимися полосами.   Производится дифференцирование спектров (на спектрах второй производной полосы почти 2 раза уже),   разложение спектров на гауссовы компоненты  и т.д. 4. Измерение спектров линейного дихроизма  (у ориентированных образцов) 5. Измерение дифференциальных спектров   (окисленный минус восстановленный, свет минус темнота,  пертурбации от температуры, влияние небольших добавок и т.д. ) 6. Измерение кинетики реакций с детектированием на заданной длине волны 7. Измерение светорассеяния Релея ( в области где отсутствует поглощение )    Какую информацию можно получить из спектрофлуориметра? Флуоресценция  - спонтанное излучение с нижнего синглетно-возбужденного  уровня     (S1  → S0).  Константа скорости этого процесса (kf)  определяется из площади под кривой в  спектре поглощения полосы  S0  → S1 и является очень стабильным параметром молекулы.  Конкурирующие с излучением безизлучательные  процессы дезактивации  синглетного  возбужденя (колебательная и тепловая дезактивация, переход в триплетное состояние, внутримолекулярный перенос протона    и т.д.)  напротив,  могут сильно зависеть от свойств окружения (рН среды, окислительно-восстановительный потенциал, вязкость,  ассоциация с другими молекулами, безизлучательный перенос энергии и т.д.).   Эта особенность делает измерения спектров флуоресценции  значительно более гибким и информативным инструментом исследования, чем спектры поглощения.  Ограничением является то, что флуоресцируют преимущественно те  молекулы, которые имеют систему сопряженных двойных связей  в жестких  циклах. Экспериментальные возможности  измерения. 1. Квантовый выход флуоресценции отношение скорости излучении к скорости поглощения фотонов. Измеряется  путем сравнения интенсивности излучения  исследуемого  образца  со стандартом, сравниваются площади под спектральными кривыми. 2. Спектр флуоресценции (СФ) - распределение интенсивности излучения по длинам волн. Спектры измеряются для обнаружения флуоресцирующих молекул и определения  их концентрации.  Для  определения  концентрации флуорофора  требуется  сравнение с    раствором известной концентрации. 3. Анализ многокомпонентной системы. Спектры флуоресценции не зависят от области  возбуждения.    Поэтому  селективное возбуждение флуоресценции монохроматическим светом в разных областях поглощения позволяет обнаружить минимальные концентрации флуорофоров  в сложных смесях. 4. Определение расстояния между флуоресцирующими молекулами при образовании  комплексов или наличия флуорофоров  в полимерной цепи  возможно по эффекту безилучательного  переноса энергии  при наличии спектрально различающихся  флуорфоров (в диапазоне 10-50 А). 5.Измерение поляризации флуоресценции позволяет оценить вязкость  системы   (мембран, липосом  и т.д.) так как  в истинных растворах флуоресценция  деполяризована. 6. Измерение рН, окислительно-восстановительного потенциала, вязкости и т.д. осуществляется  с применением  специализированных  меток и зондов. 7. Измерение кинетики реакций  по изменению концентрации  или по изменению  квантового  выхода  флуорофора  возможно при концентрациях на 2-3 порядка  меньших, чем при детектировании по поглощению.       Какую информацию можно получить из спектроскопии  кругового дихроизма  (КД)? Сигнал КД  - возникает из-за  того, что оптически активные молекулы  характеризуются  разными  коэффициентами  экстинкции  для монохроматического  света  с левой (left) - εl  и  правой (right) - εr  циркулярной поляризацией.  В результате возникает разница в  оптической плотности:                            ΔA  =   Al  - Ar  =   εl cd  -  εr cd  =  (εlεr)cd   =  Δε сd где  с – концентрация,  d – оптический путь. Величина   ΔA обычно очень мала (Δε на 2-4 порядка меньше чем ε) и чувствительность современных спектрофотометров  КД  достигает 10-5  единиц оптической  плотности.  Такая чувствительность достигается за счет того, что   высокочастотный  модулятор попеременно  преобразует  монохроматический плоско поляризованный  луч  в свет с левой  и с  правой циркулярной поляризацией.  Возникает очень маленькая модуляция  интенсивности измеряющего света и, соответственно, тока фотодетектора.  Электроника отфильтровывает и усиливает модулированную   составляющую. По свой форме,  спектр КД,  полностью  совпадает со спектром поглощения  (для изолированного электронного перехода).  Однако, он может быть как положительным, так и отрицательным. Амплитуда сигнала КД не коррелирует с амплитудой сигнала в спектре поглощения. Области применения: 1. Определение изомерии молекул. 2.  Количественное определение состава смеси изомеров. 3. Определение конфигурации агрегатов (димеров, тримеров и т.д), когда имеет место экситонное расщепление  электронных уровней. 4. Определение основных элементов вторичной структуры белков и пептидов. Широко используется для контроля за фолдингом рекомбинантных белков. 5. Определение термоустойчивости  белков и пептидов  по кривым плавления (от 5 до 90С) 6. Измерение кинетики реакций оптически активных молекул 7.  Структура нуклеиновых кислот.  Контроль образования квадруплексов у аптамеров.
  • Получение конъюгатов наночастиц золота с белками и области их применения

    Конъюгаты наночастиц золота (НЗ) с белками используют в иммуноанализе – иммуногистохимии, иммуноблоттинге, дот-иммуноанализе и иммунохроматографии, для визуального детектирования биоспецифических взаимодействий. Иммуногистохимия – это метод исследования тканей с целью выявления белков с помощью специфической реакции антиген-антитело. Дот-иммуноанализ основан на поперечном движении определяемого соединения и меченых иммунореагентов через пористый мембранный носитель с иммобилизованными антителами. Иммуноблоттинг – перенесение на твердый носитель белков, разделенных с помощью электрофореза, с последующим выявлением иммунных комплексов с помощью меченых антител. Иммунохроматографический анализ основан на движении элюента вдоль мембраны, которое приводит к образованию на разных ее участках специфических иммунных комплексов. Конъюгированный с одним из иммунореагентов (чаще всего с антителами) окрашенный маркер распределяется по мембране, и его наличие в определенных участках мембраны по окончании анализа дает информацию о наличии или отсутствии в пробе определяемых соединений. В качестве окрашенного маркера чаще всего используют НЗ диаметром от 5 до 50 нм. Наиболее распространенным методом получения НЗ является метод цитратного восстановления  золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК).  Метод заключается в том, что к кипящему водному раствору ЗХВК добавляют раствор цитрата натрия в количестве, зависящем от требуемого размера частиц. На поверхность полученных таким образом НЗ адсорбционно иммобилизуют антитела, получая конъюгаты антитела–НЗ. Оптимальную концентрацию белка при конъюгации с НЗ устанавливают на основании флокуляционных кривых, отражающих агрегацию конъюгатов при высокой ионной силе. Для построения этих флокуляционных кривых оптическую плотность агрегирующих НЗ определяют при длине волны 580 нм с использованием микропланшетного фотометра Multiskan EX. Осаждение конъюгатов антитела–НЗ, отделяющее образовавшиеся комплексы от непровзаимодействовавших молекул антител, проводят с использованием высокоскоростной настольной центрифуги с охлаждением Allegra 64R, укомплектованной тремя роторами.

    Характеристики роторов
    Обозначение ротора Макc. скорость при 20°С, об/мин Макс. ускорение при 20°С, g Макс. скорость при 4°С, об/мин Макс. ускорение при 4°С, g Макс. емкость, мл
    F1202 30 000 64 400 28 500 58 120 12 х 1,5
    F1010 26 000 57 440 22 500 43 020 10 х 10
    F0650 21 000 41 420 18 500 32 140 6 х 50

    От качества конъюгатов антитела–НЗ в значительной степени зависят качество и стабильность иммунохроматографической тест-системы в целом. Чтобы выбрать наиболее эффективный для решения данных задач препарат, варьируют размеры НЗ, соотношение антитела : НЗ и режим иммобилизации. Тестирование полученных в результате этого варьирования конъюгатов антитела–НЗ по функциональной активности – степени сохранения способности иммобилизуемого белка к рецептор-лигандным взаимодействиям (антитело-антиген, фермент-ингибитор и др.) – проводят методами иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного фотометра Multiskan EX (длина волны 450 нм) и иммунохроматографического анализа.

  • Ферментация.

    Биотехнологические процессы наработки целевого продукта при помощи микроорганизмов могут быть основаны на периодическом культивировании (batch), периодическом культивировании с подпиткой (feed-batch) и непрерывном культивировании. В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой. Однако, в ЦКП широко применяются методы batch и feed-batch культивирования, на них и остановимся более подробно. Ферментер - это закрытая емкость, в которой при определенных, контролируемых условиях (давление, температура, концен­трация сухих веществ, рН среды и т.д.) осуществляется размножение штамма-продуцента с одновременной или последующей наработкой целевого продукта.  Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальную фазу роста (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - первичные метаболиты), так и в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. — так называемые вторичные метаболиты). Периодический процесс (batch, feed-batch) включает: 1) стерилизацию сред, ферментеров и вспомогательного оборудования; 2) загрузку аппарата питательной средой; 3) внесение посевного материала; 4-1) рост культуры, который совпадает во времени с синтезом целевого продукта (batch); 4-2) рост культуры с последующим синтезом целевого продукта (feed-batch); 5) отделение целевого продукта (клетки или культуральная жидкость). При использовании периодического (batch) процесса в течение цикла культивирования питательные вещества в среду дополнительно не вводятся, продукты обмена не удаляются (не считая тех, что уносятся с газом в процессе аэрации); когда содержание целевого продукта достигает максимума, процесс прекращают. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса.

    Рис. 1 Кривые роста, исчерпания субстрата  и накопления продукта в  batch процессе. Использование периодического процесса с подпиткой (feed-batch) позволяет достичь большего выхода целевого продукта за счет пролонгированного роста и достижения большего объема биомассы, обусловленных применением дополнительных питательных веществ (субстрат, витамины и микроэлементы, индуктор), добавляемых как непрерывно, так и дробно (по сигналу датчика). Этот тип ферментации имеет ряд важных преимущества:
    • Многие целевые продукты (антибиотики, внеклеточные ферменты, полисахариды и др.), являются вторичными метаболитами, т. е. синтезируются по окончании экспоненциальной фазы роста клеток. Для того чтобы восполнять истощившуюся к этому времени питательную среду, в нее необходимо добавлять свежие питательные вещества, а также вещества-предшественники продукта.
    • Периодическое использование подпитки позволяет избежать эффекта ингибирования субстратом (высокие концентрации глюкозы, этанола) или индуктором (метанол).
    • Позволяет достигать большего выхода биомассы.
    Рис. 2 Кривые роста, подпитки и накопления продукта в  feed-batch процессе. Выбор типа ферментации и среды культивирования, как правило, обусловлен совокупностью ряда факторов:
    • Целевой белок-первичный или вторичный метаболит
    • Токсичность целевого белка для клеток продуцента
    • Стабильность целевого белка
    • Структурно-функциональные особенности целевого белка
    КЛОНИРОВАНИЕ. В ЦКП активно применяются как многокопийные, плазмидные системы, так и различные интегративные экспрессионные вектора для прокариотической (E.coli) и эукариотической (дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris) системы экспрессии, используются различные селективные маркеры. Прокариотическая система экспрессии является одним из наиболее распространенных инструментов для получения рекомбинантных белков. К преимуществам использования данной системы следует отнести:
    • Потенциально очень высокие уровни экспрессии
    • Низкая себестоимость
    • Высокая скорость и простота выращивания
    • Наличие многих факторов, позволяющих оптимизировать экспрессию.
    Несмотря на огромные преимущества прокариотическая система экспрессии обладает рядом недостатков:
    • Минимальные пост-трансляционные модификации
    • Проблемы с фолдингом белка (нарушение формирования белков в цитоплазме, включая бактериальные белки, возможные нарушения конформации, неэффективное формирование дисульфидных связей и тд.)
    • Неэффективный рефолдинг in vitro (часто нивелирует все преимущества системы в наработке белка)
    • Кодоны отличаются от эукариотических
    • Наличие эндотоксинов
    Дрожжи Saccharomyces cerevisiae длительное время находятся в лидирующей группе микробиологических объектов, используемых для продукции белков, обладающих ме­дицинской или технической ценностью. Это обусловлено как исто­ри­ческими, так и технологическими причинами, среди которых необходимо отметить – биобезопасность, относительную простоту организации, доступ­ность простых мето­дов трансформации клеток и генетических манипуляций. К достоинствам данной системы экспрессии следует отнести:
    • Способность к реализации большинства эукариотических пост-трансляционных модификаций
    • Эффективный фолдинг белка
    • Высокие уровни экспрессии
    • Низкая стоимость и простота культивирования
    • Возможность выбора между внутриклеточной продукцией и секрецией
    • Отсутствие эндотоксинов
    • Оптимизированный шаперонный и протеолитический статус
    К недостаткам данной системы следует отнести:
    • Как правило, более низкая экспрессия и секреция целевого белка, чем у Pichia pastoris
    • Гликозилирование отличается от клеток человека и млекопитающих
    • Тенденция к гипергликозилированию белков (N – гликановые структуры считаются аллергенными)
    Одной из самых перспективных систем эукариотической гетерологичной экспрессии является технология получения рекомбинантных белков при использовании высокоплотного культивирования метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. К достоинствам данной системы относятся:
    • Способность к реализации большинства эукариотических пост-трансляционных модификаций
    • Эффективный фолдинг белка
    • Высокие уровни экспрессии
    • Низкая стоимость и простота культивирования
    • Возможность выбора между внутриклеточной продукцией и секрецией
    • N-гликозилирование больше похоже на гликозилирование у высших эукариот, чем у Saccharomyces cerevisiae
    • Отсутствие эндотоксинов
    К недостаткам данной системы следует отнести:
    • Гликозилирование отличается от клеток человека и млекопитающих
    • Использование метанола (токсичное, легко-воспламеняющееся вещество) в качестве индуктора экспрессии.
    Несмотря на активное развитие генной инженерии и огромное количество литературных данных, касающихся получения гомо- и гетерологичной рекомбинантных белков, основной проблемой стоящей перед исследователем до сих пор является выбор системы экспрессии целевого белка.  К сожалению, универсальной системы экспрессии еще не разработано и при выборе реципиента исследователь должен учитывать как фундаментальные свойства каждой системы, их плюсы и минусы, так структурно-функциональные особенности целевого белка.  
  • Лабораторная установка по культивированию микроорганизмов. 1.В состав установки входят 2 блока ферментеров по 4 ферментера в каждом. Ферментеры оборудованы системой перемешивания, подачи воздуха, охлаждения и нагрева. Ферментеры оснащены датчиками измерения температуры, pH и растворенного кислорода. Электроды рН и рО2 стерилизуемы. Показания с датчиков выводятся на экран монитора компьютера. Управление процесса культивирования микроорганизмов осуществляют с помощью компьютера. При выращивании микроорганизмов возможно термостатирование, рН-статирование, можно поддерживать постоянное значение рО2 за счет увеличения оборотов мешалки. В ферментерах можно проводить выращивание бактерий, дрожжей и грибов. 2. 8 стерилизуемых аппаратов с рабочим объёмом 1,5 литра и 2 объёмом 10 литров. Данные ферментёры так же оборудованы системами перемешивания, подачи воздуха и  термостатирования. Имеются датчики контроля рН, растворимого кислорода и температуры. К каждому аппарату прилагается контроллер. На контроллер выводятся показания со всех датчиков, имеется возможность наблюдать ход процесса в динамике и, при необходимости, вносить корректировки. Для подготовки стерильных питательных сред в состав установки входят автоклавы. Для выращивания инокулята имеется термостатируемая  напольная качалка.  
Яндекс.Метрика