Отделения ЦКП

Масс-спектрометр с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией Bruker Daltonics Ultraflextreme

Масс-спектрометр Ultraflex предназначен для автоматизированных измерений масс-спектров веществ. Масс-спектрометр Ultraflex применяется при физико-химических исследованиях веществ и материалов в биохимии, биотехнологии, физической химии, химии синтетических полимеров, фармацевтике и медицине.
Прибор представляет собой автоматизированную многоцелевую измерительную систему, состоящую из ионного источника, вакуумной камеры, анализатора масс и персонального компьютера. В масс-спектрометре реализован тандемный режим, при котором используется более, чем одна стадия селекции масс ((MS)ⁿ-режим).
Ионизация производится лазерным излучением, взаимодействующим с пробами, расположенными в плоскости матрицы-мишени (Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization – MALDI метод).
Возможность программируемого сканирования проб обеспечивает высокую производительность анализа (до 384 за одну загрузку). Детектирование ионов осуществляется во время-пролетном анализаторе в линейном режиме и в режиме отражения. Прибор снабжен функцией LIFT, позволяющей производить предварительное фрагментирование ионов.
Масс-спектрометр Ultraflex позволяет определять массу продукта в диапазоне от 500Да до 120кДа,  проводить идентификацию белков методом пептидного фингерпринта с помощью сервиса Mascot с предварительной обработкой спектров программным пакетом FlexAnalysis. Также возможно выявление аминокислотных замен и модификаций белка с помощью тандемного режима прибора.
Специализацией нашего подразделения является идентификация белков методом пептидного фингерпринта, проводятся обширные исследования протеома человека, MTB и других модельных объектов.

Какую информацию можно получить из спектрофотомера ?

Электронно-колебательные спектры  молекул в  УФ  и видимой области спектра  представляют собой зависимость  показателя  поглощения монохроматического  света   от  длины  волны  (частоты).  Измеряемое спектрофотометром поглощение света  молекулами является  суммой чистого поглощения и светорассеяния.

1. Определение концентрации.
Наиболее широко используемым   показателем  поглощения   являются коэффициенты поглощения  (ε),   которые  определяется  из соотношения     ε =  А/c∙ l ,    где
А —  оптическая  плотность образца  (измеряемая  спектрофотометром),
l  — длина оптического пути  (толщина кюветы, полимерной пленке и т.д),
с  — молярная концентрация образца или же   %-ное содержание  вещества в растворе, полимерной пленке, полимерном блоке и т.д.

Процентный (весовой)  коэффициент поглощения используется в тех случаях, когда неизвестна молярная концентрация (например,  белки с неизвестной первичной последовательностью).
При определении концентрации по спектрам поглощения необходимо помнить, что спектры  поглощения  имеют фундаментальную зависимость  от температуры,  диэлектрических свойств растворителя, светорассеяния.  Основными источниками погрешности  измерений являются:
а) смещение и искривление базовой линии в результате замены кюветы с растворителем    на кювету с исследуемым раствором; б) погрешности в определении толщины кюветы;   в) искажение формы спектра из-за рассеяния  образца

2. Контроль чистоты препарата.
3. Анализ многокомпонентной системы с сильно перекрывающимися полосами.   Производится дифференцирование спектров (на спектрах второй производной полосы почти 2 раза уже),   разложение спектров на гауссовы компоненты  и т.д.
4. Измерение спектров линейного дихроизма  (у ориентированных образцов)
5. Измерение дифференциальных спектров   (окисленный минус восстановленный, свет минус темнота,  пертурбации от температуры, влияние небольших добавок и т.д. )
6. Измерение кинетики реакций с детектированием на заданной длине волны
7. Измерение светорассеяния Релея ( в области где отсутствует поглощение )

 Какую информацию можно получить из спектрофлуориметра?

Флуоресценция  — спонтанное излучение с нижнего синглетно-возбужденного  уровня     (S₁  → S₀).  Константа скорости этого процесса (k_f)  определяется из площади под кривой в  спектре поглощения полосы  S₀  → S₁ и является очень стабильным параметром молекулы.  Конкурирующие с излучением безизлучательные  процессы дезактивации  синглетного  возбужденя (колебательная и тепловая дезактивация, переход в триплетное состояние, внутримолекулярный перенос протона    и т.д.)  напротив,  могут сильно зависеть от свойств окружения (рН среды, окислительно-восстановительный потенциал, вязкость,  ассоциация с другими молекулами, безизлучательный перенос энергии и т.д.).   Эта особенность делает измерения спектров флуоресценции  значительно более гибким и информативным инструментом исследования, чем спектры поглощения.  Ограничением является то, что флуоресцируют преимущественно те  молекулы, которые имеют систему сопряженных двойных связей  в жестких  циклах.

Экспериментальные возможности  измерения.
1. Квантовый выход флуоресценции – отношение скорости излучении к скорости поглощения фотонов. Измеряется  путем сравнения интенсивности излучения  исследуемого  образца  со стандартом, сравниваются площади под спектральными кривыми.
2. Спектр флуоресценции (СФ) — распределение интенсивности излучения по длинам волн. Спектры измеряются для обнаружения флуоресцирующих молекул и определения  их концентрации.  Для  определения  концентрации флуорофора  требуется  сравнение с    раствором известной концентрации.
3. Анализ многокомпонентной системы. Спектры флуоресценции не зависят от области  возбуждения.    Поэтому  селективное возбуждение флуоресценции монохроматическим светом в разных областях поглощения позволяет обнаружить минимальные концентрации флуорофоров  в сложных смесях.
4. Определение расстояния между флуоресцирующими молекулами при образовании  комплексов или наличия флуорофоров  в полимерной цепи  возможно по эффекту безилучательного  переноса энергии  при наличии спектрально различающихся  флуорфоров (в диапазоне 10-50 А).
5.Измерение поляризации флуоресценции позволяет оценить вязкость  системы   (мембран, липосом  и т.д.) так как  в истинных растворах флуоресценция  деполяризована.
6. Измерение рН, окислительно-восстановительного потенциала, вязкости и т.д. осуществляется  с применением  специализированных  меток и зондов.
7. Измерение кинетики реакций  по изменению концентрации  или по изменению  квантового  выхода  флуорофора  возможно при концентрациях на 2-3 порядка  меньших, чем при детектировании по поглощению.  

    Какую информацию можно получить из спектроскопии  кругового дихроизма  (КД)?

Сигнал КД  — возникает из-за  того, что оптически активные молекулы  характеризуются  разными  коэффициентами  экстинкции  для монохроматического  света  с левой (left) — ε_l  и  правой (right) — ε_r  циркулярной поляризацией.  В результате возникает разница в  оптической плотности:
                           ΔA  =   A_l  — A_r  =   ε_l cd  —  ε_r cd  =  (ε_l —  ε_r)cd   =  Δε сd
где  с – концентрация,  d – оптический путь.
Величина   ΔA обычно очень мала (Δε на 2-4 порядка меньше чем ε) и чувствительность современных спектрофотометров  КД  достигает 10^-5  единиц оптической  плотности.  Такая чувствительность достигается за счет того, что   высокочастотный  модулятор попеременно  преобразует  монохроматический плоско поляризованный  луч  в свет с левой  и с  правой циркулярной поляризацией.  Возникает очень маленькая модуляция  интенсивности измеряющего света и, соответственно, тока фотодетектора.  Электроника отфильтровывает и усиливает модулированную   составляющую.
По свой форме,  спектр КД,  полностью  совпадает со спектром поглощения  (для изолированного электронного перехода).  Однако, он может быть как положительным, так и отрицательным.
Амплитуда сигнала КД не коррелирует с амплитудой сигнала в спектре поглощения.

Области применения:

1. Определение изомерии молекул.
2.  Количественное определение состава смеси изомеров.
3. Определение конфигурации агрегатов (димеров, тримеров и т.д), когда имеет место экситонное расщепление  электронных уровней.
4. Определение основных элементов вторичной структуры белков и пептидов. Широко используется для контроля за фолдингом рекомбинантных белков.
5. Определение термоустойчивости  белков и пептидов  по кривым плавления (от 5 до 90С)
6. Измерение кинетики реакций оптически активных молекул
7.  Структура нуклеиновых кислот.  Контроль образования квадруплексов у аптамеров.

Получение конъюгатов наночастиц золота с белками и области их применения

Конъюгаты наночастиц золота (НЗ) с белками используют в иммуноанализе – иммуногистохимии, иммуноблоттинге, дот-иммуноанализе и иммунохроматографии, для визуального детектирования биоспецифических взаимодействий.
Иммуногистохимия – это метод исследования тканей с целью выявления белков с помощью специфической реакции антиген-антитело.
Дот-иммуноанализ основан на поперечном движении определяемого соединения и меченых иммунореагентов через пористый мембранный носитель с иммобилизованными антителами.
Иммуноблоттинг – перенесение на твердый носитель белков, разделенных с помощью электрофореза, с последующим выявлением иммунных комплексов с помощью меченых антител.
Иммунохроматографический анализ основан на движении элюента вдоль мембраны, которое приводит к образованию на разных ее участках специфических иммунных комплексов. Конъюгированный с одним из иммунореагентов (чаще всего с антителами) окрашенный маркер распределяется по мембране, и его наличие в определенных участках мембраны по окончании анализа дает информацию о наличии или отсутствии в пробе определяемых соединений.
В качестве окрашенного маркера чаще всего используют НЗ диаметром от 5 до 50 нм. Наиболее распространенным методом получения НЗ является метод цитратного восстановления  золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК).  Метод заключается в том, что к кипящему водному раствору ЗХВК добавляют раствор цитрата натрия в количестве, зависящем от требуемого размера частиц.
На поверхность полученных таким образом НЗ адсорбционно иммобилизуют антитела, получая конъюгаты антитела–НЗ. Оптимальную концентрацию белка при конъюгации с НЗ устанавливают на основании флокуляционных кривых, отражающих агрегацию конъюгатов при высокой ионной силе. Для построения этих флокуляционных кривых оптическую плотность агрегирующих НЗ определяют при длине волны 580 нм с использованием микропланшетного фотометра Multiskan EX.
Осаждение конъюгатов антитела–НЗ, отделяющее образовавшиеся комплексы от непровзаимодействовавших молекул антител, проводят с использованием высокоскоростной настольной центрифуги с охлаждением Allegra 64R, укомплектованной тремя роторами.

Характеристики роторов

От качества конъюгатов антитела–НЗ в значительной степени зависят качество и стабильность иммунохроматографической тест-системы в целом. Чтобы выбрать наиболее эффективный для решения данных задач препарат, варьируют размеры НЗ, соотношение антитела : НЗ и режим иммобилизации.
Тестирование полученных в результате этого варьирования конъюгатов антитела–НЗ по функциональной активности – степени сохранения способности иммобилизуемого белка к рецептор-лигандным взаимодействиям (антитело-антиген, фермент-ингибитор и др.) – проводят методами иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного фотометра Multiskan EX (длина волны 450 нм) и иммунохроматографического анализа.

Ферментация.

Биотехнологические процессы наработки целевого продукта при помощи микроорганизмов могут быть основаны на периодическом культивировании (batch), периодическом культивировании с подпиткой (feed-batch) и непрерывном культивировании. В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой. Однако, в ЦКП широко применяются методы batch и feed-batch культивирования, на них и остановимся более подробно.
Ферментер — это закрытая емкость, в которой при определенных, контролируемых условиях (давление, температура, концен­трация сухих веществ, рН среды и т.д.) осуществляется размножение штамма-продуцента с одновременной или последующей наработкой целевого продукта.  Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальную фазу роста (нуклеотиды, многие ферменты, витамины — первичные метаболиты), так и в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. — так называемые вторичные метаболиты).
Периодический процесс (batch, feed-batch) включает:
1) стерилизацию сред, ферментеров и вспомогательного оборудования;
2) загрузку аппарата питательной средой;
3) внесение посевного материала;
4-1) рост культуры, который совпадает во времени с синтезом целевого продукта (batch);
4-2) рост культуры с последующим синтезом целевого продукта (feed-batch);
5) отделение целевого продукта (клетки или культуральная жидкость).
При использовании периодического (batch) процесса в течение цикла культивирования питательные вещества в среду дополнительно не вводятся, продукты обмена не удаляются (не считая тех, что уносятся с газом в процессе аэрации); когда содержание целевого продукта достигает максимума, процесс прекращают. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса.

Рис. 1 Кривые роста, исчерпания субстрата  и накопления продукта в  batch процессе.

Использование периодического процесса с подпиткой (feed-batch) позволяет достичь большего выхода целевого продукта за счет пролонгированного роста и достижения большего объема биомассы, обусловленных применением дополнительных питательных веществ (субстрат, витамины и микроэлементы, индуктор), добавляемых как непрерывно, так и дробно (по сигналу датчика).

Этот тип ферментации имеет ряд важных преимущества:

• Многие целевые продукты (антибиотики, внеклеточные ферменты, полисахариды и др.), являются вторичными метаболитами, т. е. синтезируются по окончании экспоненциальной фазы роста клеток. Для того чтобы восполнять истощившуюся к этому времени питательную среду, в нее необходимо добавлять свежие питательные вещества, а также вещества-предшественники продукта.
• Периодическое использование подпитки позволяет избежать эффекта ингибирования субстратом (высокие концентрации глюкозы, этанола) или индуктором (метанол).
• Позволяет достигать большего выхода биомассы.

Рис. 2 Кривые роста, подпитки и накопления продукта в  feed-batch процессе.

Выбор типа ферментации и среды культивирования, как правило, обусловлен совокупностью ряда факторов:

• Целевой белок-первичный или вторичный метаболит
• Токсичность целевого белка для клеток продуцента
• Стабильность целевого белка
• Структурно-функциональные особенности целевого белка

КЛОНИРОВАНИЕ.

В ЦКП активно применяются как многокопийные, плазмидные системы, так и различные интегративные экспрессионные вектора для прокариотической (E.coli) и эукариотической (дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris) системы экспрессии, используются различные селективные маркеры.
Прокариотическая система экспрессии является одним из наиболее распространенных инструментов для получения рекомбинантных белков. К преимуществам использования данной системы следует отнести:

• Потенциально очень высокие уровни экспрессии
• Низкая себестоимость
• Высокая скорость и простота выращивания
• Наличие многих факторов, позволяющих оптимизировать экспрессию.

Несмотря на огромные преимущества прокариотическая система экспрессии обладает рядом недостатков:

• Минимальные пост-трансляционные модификации
• Проблемы с фолдингом белка (нарушение формирования белков в цитоплазме, включая бактериальные белки, возможные нарушения конформации, неэффективное формирование дисульфидных связей и тд.)
• Неэффективный рефолдинг in vitro (часто нивелирует все преимущества системы в наработке белка)
• Кодоны отличаются от эукариотических
• Наличие эндотоксинов

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae длительное время находятся в лидирующей группе микробиологических объектов, используемых для продукции белков, обладающих ме­дицинской или технической ценностью. Это обусловлено как исто­ри­ческими, так и технологическими причинами, среди которых необходимо отметить – биобезопасность, относительную простоту организации, доступ­ность простых мето­дов трансформации клеток и генетических манипуляций. К достоинствам данной системы экспрессии следует отнести:

• Способность к реализации большинства эукариотических пост-трансляционных модификаций
• Эффективный фолдинг белка
• Высокие уровни экспрессии
• Низкая стоимость и простота культивирования
• Возможность выбора между внутриклеточной продукцией и секрецией
• Отсутствие эндотоксинов
• Оптимизированный шаперонный и протеолитический статус

К недостаткам данной системы следует отнести:

• Как правило, более низкая экспрессия и секреция целевого белка, чем у Pichia pastoris
• Гликозилирование отличается от клеток человека и млекопитающих
• Тенденция к гипергликозилированию белков (N – гликановые структуры считаются аллергенными)

Одной из самых перспективных систем эукариотической гетерологичной экспрессии является технология получения рекомбинантных белков при использовании высокоплотного культивирования метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. К достоинствам данной системы относятся:

• Способность к реализации большинства эукариотических пост-трансляционных модификаций
• Эффективный фолдинг белка
• Высокие уровни экспрессии
• Низкая стоимость и простота культивирования
• Возможность выбора между внутриклеточной продукцией и секрецией
• N-гликозилирование больше похоже на гликозилирование у высших эукариот, чем у Saccharomyces cerevisiae
• Отсутствие эндотоксинов

К недостаткам данной системы следует отнести:

• Гликозилирование отличается от клеток человека и млекопитающих
• Использование метанола (токсичное, легко-воспламеняющееся вещество) в качестве индуктора экспрессии.

Несмотря на активное развитие генной инженерии и огромное количество литературных данных, касающихся получения гомо- и гетерологичной рекомбинантных белков, основной проблемой стоящей перед исследователем до сих пор является выбор системы экспрессии целевого белка.  К сожалению, универсальной системы экспрессии еще не разработано и при выборе реципиента исследователь должен учитывать как фундаментальные свойства каждой системы, их плюсы и минусы, так структурно-функциональные особенности целевого белка.

Лабораторная установка по культивированию микроорганизмов.

1.В состав установки входят 2 блока ферментеров по 4 ферментера в каждом.
Ферментеры оборудованы системой перемешивания, подачи воздуха, охлаждения и нагрева.
Ферментеры оснащены датчиками измерения температуры, pH и растворенного кислорода. Электроды рН и рО₂ стерилизуемы.
Показания с датчиков выводятся на экран монитора компьютера. Управление процесса культивирования микроорганизмов осуществляют с помощью компьютера. При выращивании микроорганизмов возможно термостатирование, рН-статирование, можно поддерживать постоянное значение рО₂ за счет увеличения оборотов мешалки.
В ферментерах можно проводить выращивание бактерий, дрожжей и грибов.

2. 8 стерилизуемых аппаратов с рабочим объёмом 1,5 литра и 2 объёмом 10 литров.
Данные ферментёры так же оборудованы системами перемешивания, подачи воздуха и  термостатирования. Имеются датчики контроля рН, растворимого кислорода и температуры. К каждому аппарату прилагается контроллер. На контроллер выводятся показания со всех датчиков, имеется возможность наблюдать ход процесса в динамике и, при необходимости, вносить корректировки. Для подготовки стерильных питательных сред в состав установки входят автоклавы. Для выращивания инокулята имеется термостатируемая  напольная качалка.